14:04 Uhr
EP 01:
Identification of novel genes mediating β-cell failure
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Autor:innen:
Dr. Heja Aga | Department of Experimental Diabetology, German Institute of Human Nutrition Potsdam-Rehbruecke; German Center for Diabetes Research (DZD), München-Neuherberg | Germany
Dr. Nicole Hallahan | Deutsches Institut für Ernährungsforschung Potsdam-Rehbrücke (DIfE) | Germany
Dr. Wenke Jonas | Deutsches Institut für Ernährungsforschung Potsdam-Rehbrücke (DIfE) | Germany
Dr. Pascal Gottmann | Deutsches Institut für Ernährungsforschung Potsdam-Rehbrücke (DIfE) | Germany
Markus Jaehnert | Deutsches Institut für Ernährungsforschung Potsdam-Rehbrücke (DIfE) | Germany
PD Dr. Heike Vogel | Deutsches Institut für Ernährungsforschung Potsdam-Rehbrücke (DIfE) | Germany
Prof. Dr. Annette Schürmann | Deutsches Institut für Ernährungsforschung Potsdam-Rehbrücke (DIfE) | Germany
Background
Obesity is a complex metabolic disease that results in insulin resistance and with presence of diabetes genes in pancreatic β-cell failure. Analysis of a NZOxDBA backcross population identified one major QTL (Nidd/DBA) on chromosome 4, whereby the DBA allele enhanced hyperglycemia and ß-cell loss. The aim of this study was to identify new diabetes genes mediating β-cell loss and hyperglycemia within this locus.
Methods
Recombinant congenic mice, carrying different fragments of the Nidd/DBA locus were generated via repeated backcross to NZO. The phenotypic characterization comprised the weekly measurements of blood glucose, body weight and body composition and oral glucose tolerance tests (oGTT) at 12 weeks of age. Haplotype mapping and RNAseq of pancreatic islets from congenic mice were performed to reduce the critical fragment size and to define candidate genes.
Results
Recombinant congenic mice carrying 72.6 Mbp and 5.6 Mbp of Nidd/DBA locus developed hyperglycemia at week 12 of age, whereas homozygous NZO mice exhibited hyperglycemia only at a very late stage. OGTTs at week 12 showed enhanced insulin levels in homozygous DBA mice compared to Nidd/DBANN. Haplotype mapping of the critical region (5.6 Mbp) revealed 51 genes. Based on RNAseq data of pancreatic islets from mice carrying 5.6 Mbp, 3 genes (Spata6, Ttc39a and OsbpI9) are differently expressed between the homozygous groups.
Conclusion
By generating congenic mice and using haplotyping, the diabetes QTL Nidd/DBA was narrowed down to 5.6 Mbp, comprising 3 differently expressed islet genes, which might be causal for the locus effect.
14:09 Uhr
EP 02:
6-Phosphofructo-2-kinase/Fructose-2,6-bisphosphatase und chemische Glucokinase-Aktivatoren verändern die Enzymaktivität von Glucokinase CHI-Varianten über unterschiedliche Mechanismen
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Autor:innen:
Dr. Sara Langer | Universitätsmedizin Rostock | Germany
Dr. Anke Hofmeister-Brix | ZELLKRAFTWERK GmbH | Germany
Rica Waterstradt | Universitätsmedizin Rostock | Germany
Prof. Dr. Simone Baltrusch | Universitätsmedizin Rostock | Germany
Fragestellung
Das Enzym Glucokinase hat sowohl in β-Zellen als auch in Hepatozyten die Funktion des Glucosesensors inne und zeichnet sich durch eine hohe strukturelle Flexibilität aus. Pharmakologischen Strategien, die Enzymaktivität und damit den Blutglucosespiegel zu modulieren, steht ein unzureichendes Verständnis der intrazellulären Regulation des Enzyms entgegen.
Methodik
Die kinetischen Eigenschaften der aktivierenden CHI-Mutationen S64Y und G68V wurden im Vergleich zur Wildtyp-Glucokinase untersucht. Zusätzlich wurden auch die chemischen Aktivatoren RO-28-1675 und Compound A, der endogene Aktivator Fructose-2,6-bisphosphatase, sowie der Inhibitor Mannoheptulose eingesetzt. Mittels in silico Protein-Protein-Dockings wurde eine mögliche Fructose-2,6-bisphosphatase-Bindungsregion innerhalb des Glucokinase-Moleküls ermittelt.
Ergebnisse
Beide Mutationen liegen in der Verbindungsregion I der Glucokinase und erhöhen die Glucose-Affinität des Enzyms bei unveränderter thermischer Stabilität und intrazellulärer Lebensdauer. Die S64Y Mutation behindert die Ausbildung einer Turn-Struktur, welche charakteristisch für die inaktive Konformation des Enzyms ist. Compound A verursacht sterische Kollisionen von Tyr-64 mit der großen Glucokinase-Domäne. Dagegen führt die G68V Mutation zu Wechselwirkungen der Verbindungsregion I mit der C-terminalen α13-Helix, auch bei gleichzeitiger Bindung der chemischen Aktivatoren. Beide Mutanten wurden durch Fructose-2,6-bisphosphatase und RO-28-1675 zusätzlich aktiviert. Der Aktivator Compound A steigerte die G68V Aktivität, hemmte allerdings die S64Y Aktivität, was durch Mannoheptulose weiter verstärkt wurde. Der Interaktionspartner Fructose-2,6-bisphosphatase bindet mutmaßlich seitlich des katalytischen Spaltes der Glucokinase.
Schlussfolgerungen
Aktivierende Glucokinase-Mutationen lassen die gleichzeitige Bindung allosterischer Aktivatoren zu. Interessanterweise können sie deren Wirkung jedoch zu einer Hemmung umkehren. Der ermittelte Glucokinase-Fructose-2,6-bisphosphatase-Komplex zeigt die Notwendigkeit des Substrat-Channelings auf, wodurch die Reaktionsgeschwindigkeit durch eine Begrenzung des Diffusionsraums erhöht wird, und eröffnet neue Ansatzpunkte für die Pharmakotherapie.
14:14 Uhr
EP 03:
Investigations in the mechanisms of tolbutamide-induced desensitization of Min6-cells
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Autor:innen:
Bastian Gaus | Technische Universität Braunschweig | Germany
Dr. Dennis Brüning | Technische Universität Braunschweig | Germany
Prof. Dr. med. Ingo Rustenbeck | Technische Universität Braunschweig | Germany
Background and aims: Desensitization of insulin secretion is a well-known phenomenon and may contribute to the pathogenesis of type 2 diabetes. Defects in signal recognition and defects in secretion are both involved. Here we have investigated the functional consequences of a prolonged exposure to the KATP channel blocker, tolbutamide.
Methods: MIN6-cells were transfected with hIns-EGFP and cultured for 48-96 h in DMEM-medium. Desensitization was induced by 18 h exposure to 500 µM tolbutamide. Thereafter, tolbutamide-exposed and control cells were perifused with Krebs-Ringer-medium and stimulated by 30 mM glucose or 40 mM KCl. The number and mobility of the secretory granules was analyzed by acquiring image sequences at 8 time points utilizing TIRF-microscopy.
Results: Unexpectedly, the tolbutamide-desensitized MIN6-cells showed no significant decrease of the submembrane granule number per time point. However, the total number identified per image sequence was decreased as was the number of short-term resident granules and the number of granule arrivals at the plasma membrane. These changes point to a diminished granule turnover at the plasma membrane. Conversely, the number of long-term resident granules at the membrane was increased which was reflected by a diminished caging diameter. The latter parameter indicates a decreased mobility in the x/y-dimension, suggesting that these granules are docked. This difference was still visible after glucose and KCl stimulation.
Conclusion: Prolonged exposure to tolbutamide diminishes the granulation state of insulin-secreting cells not only quantitatively, but also qualitatively. This may be the underlying defect of depolarization-induced desensitization of insulin secretion.
14:19 Uhr
EP 04:
Permeabilität von subzellulären Membranen insulinproduzierender Zellen für Wasserstoffperoxid
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Autor:innen:
Anna Laporte | Medizinische Hochschule Hannover | Germany
Priv.-Doz Stephan Lortz | Medizinische Hochschule Hannover | Germany
Prof. Sigurd Lenzen | Medizinische Hochschule Hannover | Germany
Priv.-Doz Matthias Elsner | Medizinische Hochschule Hannover | Germany
Fragestellung: Reaktive Sauerstoffspezies spielen sowohl bei der Entwicklung eines Typ-1- als auch eines Typ-2-Diabetes eine wichtige Rolle. Die zentrale reaktive Spezies, die entweder direkt oder indirekt in verschiedenen Zellkompartimenten von Beta-Zellen gebildet wird, ist Wasserstoffperoxid. Insulinproduzierende Beta-Zellen sind aufgrund ihrer schlechten Ausstattung mit antioxidativen Enzymen besonders empfindlich gegenüber oxidativem Stress. Sowohl die Zelle selbst, als auch die Zellorganellen sind durch Lipidmembranen begrenzt. Das Ziel der vorliegenden Studie war, die Permeabilität verschiedener Zellmembranen für Wasserstoffperoxid zu analysieren und die Bewegungen von Wasserstoffperoxid in insulinproduzierenden Zellen zu beobachten. Darüber hinaus wurde der Einfluss einer Katalase-Überexpression sowie einer Fettsäurebehandlung auf die Membranpermeabilität für Wasserstoffperoxid untersucht.
Methodik: Das Wasserstoffperoxid-Sensorprotein HyPer wurde stabil in verschiedenen Kompartimenten bzw. an Membranoberflächen in insulinproduzierenden RINm5F-Zellen exprimiert. Zusätzlich wurden die Zellen mit Fettsäuren vorinkubiert oder Katalase bzw. D-Aminosäureoxidase überexprimiert. Mittels Fluoreszenzmikroskopie wurde die Kinetik des Wasserstoffperoxid-Sensorproteins während einer Umströmung mit Wasserstoffperoxid oder D-Alanin in Echtzeit verfolgt.
Ergebnisse: Die Ergebnisse der Umströmung mit exogenem Wasserstoffperoxid zeigten, dass Organellmembranen unterschiedlich permeabel für Wasserstoffperoxid sind. Die Membranpermeabilität stellte allerdings keinen limitierenden Faktor für den Wasserstoffperoxid-Eintritt in Organellen dar. Eine Vorinkubation mit der gesättigten Fettsäure Palmitinsäure, nicht aber mit der ungesättigten Fettsäure Ölsäure, führte zu einer erhöhten Wasserstoffperoxid-Permeabilität der peroxisomalen Membran.
Schlussfolgerungen: Diese Wasserstoffperoxid-Diffusionsanalyse erlaubt eine Aussage über die Permeabilität verschiedener Membranen in insulinproduzierenden Zellen unter dem Einfluss von pathologischen Faktoren des Diabetes wie z.B. erhöhten Fettsäurekonzentrationen oder gesteigerter Insulinfaltung im ER. Palmitinsäure steigert signifikant die Permeabilität der peroxisomalen Membran für Wasserstoffperoxid und könnte auf diesem Wege die Lipotoxizität gesättigter Fettsäuren verstärken.
14:24 Uhr
EP 05:
ATP triggers Katp channel opening without hydrolysis
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Autor:innen:
Jelena Sikimic | Universität Tübingen | Germany
Prof. Dr. Joseph Bryan | Pacific Northwest Research Institute | United States
Prof. Dr. Peter Krippeit-Drews | University of Tübingen | Germany
Prof. Dr. Gisela Drews | University of Tübingen | Germany
Objective: KATP channels, (SUR1/Kir6.2)4, couple the membrane potential of neuroendocrine cells to their metabolic state. Channel activity is regulated positively by ATP and ADP binding to SUR1 and negatively by nucleotide binding to Kir6.2. It is hypothesized that channel opening requires MgATP hydrolysis by SUR1.
The aim of the study was to test whether solely ATP binding, without hydrolisis, is sufficient for channel activation.
Methods: Stable transfected HEK-293 cells coexpressing wildtype or mutant hamster Abcc8/SUR1 and wildtype or mutant human Kcnj11/Kir6.2 were used. Channel activity was tested between 24-72 hours after activation with doxicyclin (300µM) using the inside/out configuration of the patch clamp technnique.
Results: To test the hypothesis we used recombinant KATP channels whose Kir6.2G334D pore subunits are poorly inhibited by ATP and whose regulatory SUR1Q1178R or SUR1E1507Q subunits have increased affinities for ATP. Additionally, the E1507Q substitution replaces the catalytic glutamate needed for efficient hydrolysis. Both channels were significantly activated by 10mM ATP4-( open probability (NPo) increased from 0.22±0.14 to 0.99±0.53 (n=6) and from 0.08±0.03 to 0.99±0.53 (n=6), respectively). 10mM GTP4 significantly elevated NPo for SUR1 Q1178R/Kir6.2G334D (from 0.33±0.12 to 0.86±0.25 (n=6)). In addition, diazoxide which is thought to act only with ATP hydrolysis, opened channels expressing wildtype Kir6.2 and SUR1E1507K in the presence of ATP4-.
Conclusion: Our findings show that ATP acts as a KATP channel agonist probably by switching SUR1 from inward to outward facing conformation which triggers channel openings.
14:29 Uhr
EP 06:
Ghrelin influences β-cell function by interference with KATP channels
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Autor:innen:
Julia Marion Kaiser | Universität Tübingen | Germany
Prof. Dr. Peter Krippeit-Drews | Universität Tübingen | Germany
Prof. Dr. Gisela Drews | Universität Tübingen | Germany
Objective
Ghrelin is well known as a hunger-inducing hormone which is mainly secreted from stomach cells. Meanwhile it has become evident, that ghrelin is produced in the pancreas as well and influences β-cell function. For many years it was well accepted, that ghrelin decreases glucose stimulated insulin secretion (GSIS) through the growth hormone secretagogue receptor 1a (GHS-R1a) coupled to Gαi/cAMP/TRPM2. This assumption was recently challenged by the discovery that the GHS-R1a is expressed in δ-cells. Accordingly, ghrelin may induce the secretion of somatostatin, which, in turn, acts in a paracrine manner on β-cells and inhibits GSIS.
Aims The aim of this study was to further elucidate how ghrelin interferes with β-cell function. Methods Patch-clamp and fluorescence techniques and RIA were used to determine [Ca2+]c, GSIS, and electrophysiological parameters in β-cells or islets of WT and SUR1-KO mice.
Results Ghrelin significantly hyperpolarized membrane potential (n=9) and decreased [Ca2+]c (n=20) and GSIS at stimulating glucose concentration. These effects were abolished in β-cells and islets from SUR1-KO mice. Ghrelin had no influence on KATP single channel current in excised patches (n=8), but increased KATP current in a whole-cell configuration with intact metabolism (n=8). Furthermore, the inhibition of GSIS could be prevented in the presence of db-cAMP (n=8) or IBMX (n=5) and with the somatostatin receptor 2-5 (SST-R2-5) antagonist H6056 (n=6).
Conclusion These data indicate that ghrelin indirectly opens KATP channels probably by interference with the cAMP/PKA pathway resulting in a decrease of [Ca2+]c and GSIS. There is evidence for the involvement of SST-R2-5.
14:34 Uhr
EP 07:
Eine verminderte Expression von Mff führt zu einer fragmentierten mitochondrialen Netzwerkstruktur und einer reduzierten ATP Bereitstellung in Beta-Zellen
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Autor:innen:
Dr. Julia Schultz | Universität Rostock | Germany
Caroline Voigt | Universität Rostock | Germany
Rica Waterstradt | Universität Rostock | Germany
Prof. Dr. Simone Baltrusch | Universität Rostock | Germany
Fragestellung:
Mitochondrien bilden in der Zelle ein dynamisches tubuläres Netzwerk, welches durch ständige Fusions- und Teilungsprozesse aufrechterhalten wird. Eine Balance der Mitochondriendynamik ist für die Aufrechterhaltung der Beta-Zell Funktion wichtig. Der mitochondriale fission factor (Mff) reguliert durch Rekrutierung des Dynamin-Related Protein 1 (Drp1) die Teilung von Mitochondrien. Bei einem Defekt dieses Teilungsprozesses kommt es zu Veränderungen von Mitochondrienmorphologie und -funktion. Der Abbau von defekten Mitochondrien wird durch Mitophagie reguliert, um die Beta-Zell Funktion aufrecht zu erhalten. Ziel dieser Studie war es, die Rolle von Mff im mitochondrialen Teilungsprozess und dessen Einfluss auf den Stoffwechsel von Beta-Zellen zu untersuchen.
Methodik:
Eine verminderte Expression von Mff in MIN6 Zellen und primären Maus Inselzellen wurde mittels spezifischer siRNA erreicht. Die mitochondriale Struktur wurde durch MTGreen und einer Tom20 Immunfluoreszenz analysiert, das mitochondriale Membranpotential mit TMRE. Die Zellatmung wurde mit einem Micro-Optode Sensorsystem und der ATP-Gehalt mit dem ATPlite-Assay bestimmt. Die Expression von Regulatoren der Mitophagie und Mitochondriendynamik wurde durch RT-PCR untersucht.
Ergebnisse:
Im Gegensatz zu einer homogenen Netzwerkstruktur in siRNA-kontrolltransfizierten Beta-Zellen, kam es nach Behandlung mit Mff-siRNA zu einer starken Fragmentierung der Mitochondrien. Die gebildeten Cluster und Loop-Strukturen wurden nicht durch Mitophagie eliminiert. Die verminderte Expression von Mff führte in MIN6 Zellen zudem zur Reduktion des mitochondrialen Membranpotential, des ATP-Gehalts und der Zellatmung im Vergleich zu den siRNA-kontrolltransfizierten Zellen.
Schlussfolgerung:
Diese Studie zeigt die Bedeutung von Mff beim mitochondrialen Teilungsprozess in Beta-Zellen auf. Die bei verminderter Mff Expression stark fragmentierte Netzwerkstruktur führt zur Reduktion der mitochondrialen ATP Bereitstellung, die für die Stimulus-Sekretionskopplung von wesentlicher Bedeutung ist.
14:39 Uhr
EP 08:
Drp1 ist ein wichtiger Regulator der mitochondrialen Netzwerkstruktur und Mitophagierate in Beta-Zellen
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Autor:innen:
Magdalena Otte | Unimedizin Rostock | Germany
Dr. Julia Schultz | Universitätsmedizin Rostock | Germany
Prof. Dr. Simone Baltrusch | Universitätsmedizin Rostock | Germany
Fragestellung:
Die komplexe mitochondriale Netzwerkstruktur wird in Beta-Zellen durch ständige Fusions- und Teilungsprozesse den Notwendigkeiten der Stimulus-Sekretionskopplung angepasst. Unter den die Mitochondriendynamik regulierenden Proteinen übernimmt das Dynamin-Related Protein (Drp1) eine wichtige Funktion, da es durch seine GTPase-Aktivität elongierte Mitochondrien voneinander abschnüren kann. Es ist daher eine Zielstruktur zur Behandlung einer mitochondrialen Dysfunktion. Diese wird auch als Ursache eines Typ 2 Diabetes mellitus diskutiert. Das Ziel dieser Studie ist es, den Einfluss einer veränderten Drp1 Expression und Aktivität auf die Morphologie und Funktion der Mitochondrien in Beta-Zellen zu untersuchen.
Methodik:
Es wurde die murine glucoseresponsive Beta-Zelllinie MIN6 verwendet. Die zelluläre Inaktivierung von Drp1 erfolgte durch Inkubation mit dem GTPase-Inhibitor mdivi-1 für 24h, die verstärkte Expression mit Hilfe des Vektors pcDNADrp1(+). Das mitochondriale Netzwerk wurde fluoreszenzmikroskopisch mittels MitoTracker Green und die Expression Mitophagie-assoziierter Gene durch quantitative RT-PCR analysiert.
Ergebnisse:
MIN6 Zellen zeigten ein homogenes mitochondriales Netzwerk vergleichbar dem primärer Beta-Zellen. Nach Reduktion der Drp1 Aktivität war das Netzwerk signifikant elongiert. Die verstärkte Expression von Drp1 führte dagegen zu einem stark fragmentierten mitochondrialen Netzwerk. Die Expression der Mitophagie-assoziierten Gene LC3, ATG9A, PINK1 und PARKIN war bei erhöhtem Drp1-Gehalt im Vergleich zu kontrolltransfizierten Zellen nicht verändert. Die Inaktivierung von Drp1 führte zu einer signifikant erhöhten Expression der Mitophagie-assoziierten Gene.
Schlussfolgerungen:
Veränderungen in der Expressionsrate und Aktivität von Drp1 resultieren in morphologischen Veränderungen des mitochondrialen Netzwerkes in Beta-Zellen. Aufgrund der fehlenden Mitophagie ist von einer reduzierten mitochondrialen Aktivität auszugehen. Wie sich dies auf die Funktion der Beta-Zelle auswirkt, gilt es weiterführend zu klären.
14:44 Uhr
EP 09:
ICA512 RESP18 homology domain is protein condensing factor and insulin fibrillation inhibitor
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Autor:innen:
Dr. Juha Torkko | Paul Langerhans Institute Dresden - German Center for Diabetes Research (DZD e.V.) | Germany
Pamela Toledo | Universidad Nacional de Quilmes | Argentina
Dr. Andreas Müller | Paul Langerhans Institute Dresden - German Center for Diabetes Research (DZD e.V.) | Germany
Carolin Wegbrod | Paul Langerhans Institute Dresden - German Center for Diabetes Research (DZD e.V.) | Germany
Anke Sönmez | Paul Lamgerhans Institute Dresden - German Center for Diabetes Research (DZD e.V.) | Germany
Prof. Dr. Michele Solimena | Paul Langerhans Institute Dresden - German Center for Diabetes Research (DZD e.V.) | Germany
Prof. Dr. Mario Ermácora | Universidad Nacional de Quilmes | Argentina
Type 1 diabetes islet cell autoantigen ICA512)/IA-2/PTPRN is a catalytically inactive receptor tyrosine phosphatase involved in the biogenesis and turnover of insulin secretory granules (SGs) in the β-cells of the pancreatic islets. Whereas the ICA512 proximal luminal ectodomain has been functionally and structurally characterized, the role of its preceding N- terminal luminal segment, termed regulated endocrine-specific protein 18-homology domain (RESP18HD) encompassing amino acids 35-131 remains largely unknown. Here we show that ICA512 RESP18HD C-terminal motif including residues 91-131 contains an intrinsically disordered region (IDR), which is critically required for RESP18HD function as a pH and Zn2+ dependent condensation and reversible aggregation factor for insulin and other β-cell proteins. At variance with other SG cargoes with aggregating properties, the condensing activity of ICA512 RESP18HD is displayed at pH values close to neutral, as found in the early secretory pathway, while being resolved at acidic pH and in the presence of high Zn2+ concentrations, as found in mature insulin SGs. Moreover, we show that the ICA512 RESP18HD portion including amino acids 35-90, i.e. the region preceding the IDR, inhibits insulin fibrillation in vitro. Finally, we show that glucose-stimulated release of ICA512 RESP18HD from the SGs is associated with proteolysis of its IDR, conceivably to prevent its aggregation upon exposure to neutral pH in the extracellular milieu. Taken together, these findings point to ICA512 RESP18HD being a condensing factor for SG protein sorting and granulogenesis early in the secretory pathway and for prevention of insulin fibrillation.
14:49 Uhr
EP 10:
Multi-omics insight into amyloidosis of islets from metabolically stratified living surgical donors
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Autor:innen:
Marko Barovic | Paul Langerhans Institute Dresden | Germany
Dr. Klaus Steinmeyer | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Germany
Mark Ibberson | Swiss Institute for Bioinformatics | Switzerland
Prof. Dr. med. Jürgen Weitz | University Hospital Carl Gustav Carus of the Technical University Dresden | Germany
Prof. Dr. med. Daniela Aust | University Hospital Carl Gustav Carus of the Technical University Dresden | Germany
Dr. Anke Schulte | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Germany
Prof. Dr. Michele Solimena | Paul Langerhans Institute Dresden | Germany
Introduction: Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) and its complications affect hundreds of millions of patients worldwide, reducing quality of life and burdening healthcare systems. Although islet amyloidosis has been recognized as an associated phenomenon to the beta cell failure in the context of T2DM, exact role of islet amyloidosis to the deterioration of beta cell function in T2DM remains elusive.
Aim: Elucidate the role of islet amyloidosis in onset and development of beta cell failure in T2DM using a multi-omics approach.
Materials and methods: Formalin fixed paraffin embedded sections of pancreatic tissue from metabolically profiled pancreatectomized patients (PPP) were stained using Congo red and Thioflavin S to detect amyloid. Laser capture microdissected islets retrieved from the same donors have been or are being subjected to DNA sequencing, RNA sequencing and mass spectrometry for proteomics. This data will be integrated and correlated with abundant clinical information available about each individual donor.
Results and outlook: We determined superior sensitivity of Thioflavin S staining compared to Congo red in detection of islet amyloid plaques (detected in 52% and 24% of samples, respectively). After acquisition of remaining islet proteomes, we will proceed with bioinformatic analysis and integration of high throughput data with clinical parameters of the patients. This approach will result in an unprecedented comprehensive systems biology prospective of the phenomenon of islet amyloidosis.
14:54 Uhr
EP 11:
Fetuin-A reverses functional maturation of beta-cells
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Autor:innen:
Dr. Felicia Gerst | Helmholtz Zentrum München | Germany
Prof. Dr. Elisabeth Kemter | LMU Munich | Germany
Dr. Gabriele Kaiser | Helmholtz Zentrum München | Germany
Dr. Estela Lorza Gil | Helmholtz Zentrum München | Germany
Dipl.-Bio. Ann-Kathrin Fritz | University Hospital Tuebingen | Germany
Prof. Dr. Eckhard Wolf | LMU Munich | Germany
Prof. Dr. Hans-Ulrich Häring | Helmholtz Zentrum München | Germany
Prof. Dr. Susanne Ullrich | Helmholtz Zentrum München | Germany
Introduction and aim: Type 2 diabetic islets lose their glucose responsiveness, this process being a major cause of chronic hyperglycaemia. We previously reported that the foetal protein fetuin-A, which is secreted by the fatty liver, inhibits glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) in isolated human islets. The hepatokine fetuin-A is a TGFbeta antagonist, pathway essential for the functional maturation of the neonatal beta-cells. The aim of this study is to assess whether fetuin-A impacts on neonatal islet maturation by interfering with TGFBR/BMPR signalling and to decipher the underlying signalling pathways. Methods: The effects of fetuin-A on beta-cells maturation were examined in pig neonatal islet cell clusters (NICCs). Freshly isolated, glucose-unresponsive NICCs were maturated in serum-free medium supplemented with 0.6 mg/ml human serum albumin (control). TGFbetaR/BMPR signalling was inhibited by either fetuin-A (0.6 mg/ml) or pharmacologically by SB431542 or LDN193189. Gene expression was analysed by RNA sequencing and RT-qPCR, protein expression by western blotting. Results: RNAs sequencing analysis revealed upregulation of islet cell specific genes during in vitro maturation including INS, GCG, SST, PPY; hormone convertases PCSK1/2; transcription factors NEUROD1, PAX4, MAFB; proteins important for GSIS: GCK, ABCC8 (SUR1), SLC2A2 (GLUT2), SYT4/7/13, PPP1R1A; membrane receptors: FFAR3/4, SSTR2/3, GIPR and the marker of the functionally mature beta-cells UCN3. TGFbetaR inhibitor SB431542 lowered the expression of beta-cell genes, which suggests that NICCs maturation depends on active TGFBR pathway. Fetuin-A inhibited phosphorylation of SMAD2/3 and reduced the expression of islet cell specific genes. Conclusion: These observations suggest that fetuin-A impairs beta-cell maturation via inhibition of TGFBR.
14:59 Uhr
EP 12:
Expression und Funktion von Rab3B in murinen und humanen Beta-Zellen des Pankreas
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Autor:innen:
Dr. Cindy Zehm | Universitätsmedizin Rostock | Germany
Rica Waterstradt | Universitätsmedizin Rostock | Germany
Prof. Dr. Simone Baltrusch | Universitätsmedizin Rostock | Germany
Rab Proteine sind monomere GTPasen, die den Vesikelfluss in der Zelle koordinieren und somit auch den Transport und die Exocytose von Insulingranula in Beta-Zellen vermitteln. Neben dem gut untersuchten Rab3A könnte das ebenfalls zu dieser Familie gehörende Rab3B hierbei eine wichtige Rolle spielen. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, die Expression und die Funktion von Rab3B in Beta-Zellen zu untersuchen.
Methodik: Die Expression der Rab Proteine in isolierten Langerhansschen Inseln aus C57BL/6J Mäusen und humanem Pankreas, sowie in der klonalen Beta-Zelllinie MIN6 wurde mittels RT-PCR, Western Blot und in immunhistochemischen Analysen untersucht. MIN6-Zellen wurden mit lentiviralen Rab3A, Rab3B oder Kontroll shRNA-Konstrukten behandelt. Die glucoseinduzierte Sekretion von Insulin wurde mittels ELISA bestimmt.
Ergebnisse: Sowohl in murinen und humanen Langerhans´schen Inseln, als auch in der Beta-Zelllinie MIN6 konnte die Expression von Rab3B nachgewiesen werden. Wurden MIN6 Zellen gehungert und zusätzlich mit Palmitinsäure inkubiert, zeigte sich eine verstärkte Expression. Rab3A und Rab3B wiesen eine unterschiedlich starke Co-Lokalisation mit Insulingranula auf. Außerdem wurde für Rab3B in MIN6-Zellen eine partielle Co-Lokalisation mit dem Autophagiemarker ATG9A und überraschenderweise in isolieren murinen Inseln auch mit Glucagon-positiven Zellen nachgewiesen. Mittels shRNA konnte eine signifikante Reduktion der Rab3A und Rab3B Expression in MIN6-Zellen erzielt werden. Die Analyse der Stimulus-Sekretionskopplung ergab für beide Rab Proteine eine sifnifikante Abnahme der glucoseinduzierten Insulinsekretion.
Schlussfolgerung: Auch Rab3B ist an der Regulation der Insulinsekretion in Beta-Zellen beteiligt. Da eine Störung der Funktion dieser GTPase zur Entstehung eines Typ 2 Diabetes mellitus beitragen könnte, sollen die Rab3B-abhängien Vorgänge bei der Insulinsekretion weiterführend aufgeklärt werden.
15:04 Uhr
EP 58:
Knockdown of Etv5 enhances nitric oxide production and caspase-independent cell death in pancreatic INS-1E β-cells
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Autor:innen:
Dr. Fupeng Liu | Uniklinik Freiburg | Germany
Xuanzi Yi | Uniklinik Freiburg | Germany
Marco Ringwald | Uniklinik Freiburg | Germany
Prof. Dr. med. Jochen Seufert | Uniklinik Freiburg | Germany
Dr. Günter Päth | Universitätsklinikum Freiburg | Germany
The transcription factor ETV5 is widely expressed and regulates diverse genes including a whole string related to obesity and diabetes. ETV5 is involved in the regulation of glucose-induced insulin secretion from β-cells and its pancreatic loss increases the severity of pancreatitis. On this account, we investigated whether ETV5 is regulated by nutritional states and whether it plays a role in proliferation and survival from cellular stress using rat INS-1E β-cells and doxycycline-inducible shRNA knockdown of Etv5. Neither low or high glucose conditions nor serum deprivation had an effect on ETV5 expression in normal INS-1E β-cells while streptozotocin and palmitate time- and dose-dependently induced its expression to significant levels after 24 h. Etv5 knockdown did not change proliferation but significantly further enhanced streptozotocin- and palmitate-mediated loss of viability. In this context, Etv5 knockdown neither had an impact on the expression of the proliferative and anti-apoptotic proteins NUPR1 and RET nor on caspases-3 and -7 activation levels. Instead, Etv5 knockdown was associated with increased basal nitric oxide production and augmented caspase-independent cell death upon exposure to streptozotocin and palmitate. In conclusion, ETV5 seems to limit nitric oxide production and may thereby play a role in the protection of β-cells from necrosis upon certain cellular stresses.
15:09 Uhr
EP 59:
Struktur-Wirkungs-Beziehungen verschiedener gesättigter und ungesättigter freier Fettsäuren mit Blick auf die lipotoxischen Mechanismen in humanen EndoC-βH1 β-Zellen
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Autor:innen:
Dr. Thomas Plötz | Medizinische Hochschule Hannover | Germany
Anna-Sophie von Hanstein | Medizinische Hochschule HAnnover | Germany
Bastian Krümmel | Medizinische Hochschule Hannover | Germany
Anna Laporte | Medizinische Hochschule Hannover | Germany
Dr. Ilir Mehmeti | Medizinische Hochschule Hannover | Germany
Prof. Sigurd Lenzen | Medizinische Hochschule Hannover | Germany
Fragestellung: Der Typ-2-Diabetes ist assoziiert mit chronisch erhöhten Plasmakonzentrationen freier Fettsäuren (FFAs), die zur β-Zelldysfunktion und Apoptose führen können. Der Mechanismus der FFA-vermittelten β-Zell-Apoptose ist jedoch nicht vollständig geklärt. Ziel dieser Studie war es daher, die zugrunde liegenden Pathomechanismen der Lipotoxizität in der humanen EndoC-βH1 β-Zelllinie anhand von Struktur-Wirkungs-Beziehungen zu untersuchen.
Methodik: EndoC-βH1 Gewebekulturzellen wurden mit langkettigen (LC) und sehr-langkettigen (VLC) gesättigten und ungesättigten FFAs inkubiert. Die Toxizität wurde mittels Caspase-3, organellspezifische Wasserstoffperoxidbildung durch das Wasserstoffperoxid-Sensorprotein HyPer analysiert. Lipid droplets (LDs) wurden anhand einer Oil Red O-Färbung fluoreszenzmikroskopisch bestimmt. Die ER-Stress-Gene wurden nach FFA-Inkubation durch RT-qPCR unter Verwendung spezifischer Primer quantifiziert.
Ergebnisse: Sowohl gesättigte als auch einfach-ungesättigte FFAs (≥16 Kohlenstoffatome) waren für humane EndoC-βH1 β-Zellen toxisch. Mit zunehmender Kettenlänge stieg die Toxizität an, wohingegen mit zunehmender Anzahl an Doppelbindungen die Toxizität abnahm. Im Allgemeinen korrelierte die FFA-Toxizität mit dem Metabolismus in der peroxisomalen β-Oxidation, wobei das toxische Wasserstoffperoxid gebildet wird. Bei sehr toxischen VLC FFAs kam es zusätzlich zur signifikanten Wasserstoffperoxidbildung in den Mitochondrien. Die ER-Stressantwort wurde ausschließlich durch VLC gesättigte FFAs induziert, wohingegen LC und VLC ungesättigte FFAs diese nicht auslösten. Im Gegensatz dazu bildeten VLC gesättigte FFAs keine LDs, wogegen alle anderen analysierten LC und VLC FFAs eine signifikante LD-Bildung aufwiesen.
Schlussfolgerungen: Diese Daten zeigen, dass die FFA-vermittelte β-Zelltoxizität von Struktur und Kettenlänge der FFAs abhängt. Sie korreliert mit dem Stoffwechsel der FFAs in der β-Oxidation und geht mit peroxisomalem, mitochondrialem und/oder ER-Stress einher. Die LD-Bildung scheint zudem eine schützende Wirkung gegenüber der Induktion der ER-Stressantwort zu haben.