12:15 Uhr
P10 - 01:
Einfluss von Hyaluronsäure auf die Funktion von natürlichem Surfactant
G. Auerswald (Lübeck, DE)
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Autor:innen:
G. Auerswald (Lübeck, DE)
G. Walter (Lübeck, DE)
E. Herting (Lübeck, DE)
G. Stichtenoth (Lübeck, DE)
Hintergrund:
Die Surfactantsubstitution stellt noch immer den Goldstandard in der Behandlung des Atemnotsyndroms des Früh- und Neugeborenen dar. In der Vergangenheit konnte bereits gezeigt werden, dass Hyaluronsäure in vitro positive Effekte auf die Oberflächenaktivität von Surfactant hat. Gleichzeitig ist Hyaluronsäure als Bestandteil der Extrazellulärmatrix auch in der Lunge zu finden. Unsere Arbeit beleuchtet erstmals die physiologischen Zusammenhänge zwischen Hyaluronsäure und natürlichem Surfactant in humanen Fruchtwasserproben, die während operativen Entbindungen entnommen wurden.
Fragestellung:
1. Ist die Oberflächenaktivität und Konzentration des Surfactants gestationsalterabhängig im Fruchtwasser nachweisbar?
2. Korreliert die Surfactantaktivität bzw. Phospholipidkonzentration mit dem physiologischen Hyaluronsäuregehalt im Fruchtwasser?
3. Ist die amniale Hyaluronsäurekonzentration abhängig vom Gestationsalter?
Material und Methoden:
Über einen Zeitraum von 18 Monaten wurden in der geburtshilflichen Abteilung des UKSH Lübeck während Sectiones caesareae 195 Fruchtwasserproben gesammelt, zelldepletiert und per Ultrazentrifugation und anschließender Resuspension aufbereitet. Die biophysikalische Aktivität der Proben wurde mit Hilfe des Captive-Bubble-Surfactometers untersucht. Zur Bestimmung der Phospholipid- und Hyaluronsäurekonzentration wurde jeweils ein ELISA verwendet.
Ergebnisse:
Während das aus Fruchtwasserproben präparierte Surfactant mit zunehmender Reife und Gewicht der Neugeborenen eine verbesserte Oberflächenaktivität zeigte, nahm die Hyaluronsäurekonzentration im Fruchtwasser mit zunehmender Reife ab. Bzgl. der Korrelation zwischen Hyaluronsäurekonzentration und Oberflächenaktivität waren zwar keine signifikanten Ergebnisse zu erzielen, es zeigte sich jedoch als Trend eine ansteigende Hyaluronsäurekonzentration bei niedriger Surfactantaktivität.
Diskussion:
Während die pulmonale Hyaluronsäure zwar im Rahmen des ARDS des Erwachsenen zunehmend Bestandteil der Forschung ist, sind die Zusammenhänge beim RDS des Früh- und Neugeborenen noch weitestgehend unerforscht. Als limitierende Faktoren unserer Arbeit müssen die Verunreinigung der Proben durch Mekonium oder Blutbestandteile sowie das unbekannte Molekulargewicht der gemessenen Hyaluronsäure benannt werden. Letzteres kann Hinweise auf den Ursprung geben. Als Material erscheint abgesehen von Fruchtwasser insbesondere oronasales Absaugsekret für weitere Hyaluronsäure- und Surfactantanalysen vielversprechend. Zudem bietet die niedermolekulare pulmonale Hyaluronsäure, die beim ARDS bereits als Inflammationsmarker erforscht ist, auch im Rahmen des Amnioninfektionssyndroms vielfältige Möglichkeiten, um ggfs. Zusammenhänge zum Atemnotsyndrom herzustellen. Aus therapeutischer Sicht bietet die Hyaluronsäure aufgrund der positiven Effekte auf die Surfactantfunktion z.B. als Inhalation eine mögliche Option, um die Behandlung des Atemnotsyndroms in Zukunft sinnvoll zu ergänzen
12:21 Uhr
P10 - 02:
The role of the HIF-1α signaling pathway on damage and repair mechanisms during oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD/R) injury on BV2 microglia
L. Mußotter (Berlin, DE)
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Autor:innen:
L. Mußotter (Berlin, DE)
C. Bührer (Berlin, DE)
S. Endesfelder (Berlin, DE)
T. Scheuer (Berlin, DE)
T. Schmitz (Berlin, DE)
Background
Neonatal hypoxia-ischemia (HI) is a common cause of morbidity and mortality in neonates. It can result in persistent motor, sensory, and cognitive impairments. Recent evidence suggests that the transcription factor hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) plays a key role in neurological outcomes after HI. Microglia are brain resident macrophages that respond rapidly to HI by producing proinflammatory mediators via a HIF-1α-dependent mechanism. However, the precise role of HIF-1α - dependent repair and damage mechanisms on the formation of brain injury after a hypoxic-ischemic brain event in microglia is still poorly understood.
Objective
Therefore, the purpose of this study is to explore the mechanisms of HIF-1α - dependent repair and damage mechanisms on BV2 microglia after hypoxic-ischemic injury. Using the oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD/R) treatment as a model of hypoxia-ischemia, this study aims to determine (i) how OGD treatment (2, 4, 6 h) affects proliferation, inflammation, cell death, and growth factor secretion of BV2 microglia, (ii) how BV2 microglia respond after 24 h of reoxygenation and (iii) how the absence of HIF-1α affects cell injury.
Methods
In vitro, primary microglia proliferate only after activation. Due to cell number limitations, we used the immortalized mouse microglial cell line BV2. Several studies reported BV2 cells as an adequate alternative for primary microglia in different experimental approaches. For OGD experiment, BV2 cells were once washed with PBS and culture medium was replaced by glucose- and oxygen-free DMEM. Cells were incubated at 37°C in a humid atmosphere containing 95% N2, 5% CO2 and 0% O2. Control cells were incubated at 21% O2 and culture medium containing glucose. For reoxygenation, cells were incubated at normal culture conditions for additional 24 h. Knockdown experiments were performed by transfecting cells with HIF-1α specific siRNA or control siRNA. To analyze the impact of OGD/R on cell death with or without HIF-1α knockdown we performed ToxyLight Bioassay. Similarly, the levels of pro-inflammatory cytokines, proliferation marker and oxidative stress response (TNF-α, IL-1β, CycD2, Gclc, iNOS, IGF1 and MHC2) were detected using qRT-PCR. Ki-67 immunocytochemistry was performed to detect proliferation. HIF-1α protein levels were measured using western blot.
We will present our data in June 2023.
12:27 Uhr
P10 - 03:
Identifikation und Erprobung des therapeutischen Potenzials stammzell-basierter Therapieansätze im Modell der neonatalen Schädigung des sich entwickelnden Gehirns und der Lunge
S. Obst (Essen, DE)
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Autor:innen:
S. Obst (Essen, DE)
M. Serdar (Essen, DE)
K. Kempe (Essen, DE)
M. Rizazad (Essen, DE)
J. Herz (Essen, DE)
M. Möbius (Dresden, DE)
M. Rüdiger (Dresden, DE)
M. Alcazar (Köln, DE)
S. Endesfelder (Berlin, DE)
U. Felderhoff-Müser (Essen, DE)
I. Bendix (Essen, DE)
Hintergrund: Mit etwa 11% aller Neugeborenen weltweit ist eine Frühgeburt eine der häufigsten Ursachen für Mortalität und Langzeitmorbidität. Trotz steigender Überlebensrate durch verbesserte neonatale Versorgung sind Langzeiterkrankungen wie die Enzephalopathie des Frühgeborenen (EoP) und die bronchopulmonale Dysplasie (BPD) jedoch weiterhin hoch. Eine Ursache ist die Exposition der Frühgeboren an den in der Atmosphäre herrschenden Sauerstoff. Diese relative Hyperoxie (HO) kann durch notwendige Behandlungen wie zusätzlicher Beatmung verstärkt werden. Derzeit gibt es keine kausale Therapie zur Behandlung der EoP und BPD. Mesenchymale Stammzellen (MSZ) zeigten bereits vielversprechende Effekte in experimentellen Studien zu neonataler Hirnschädigung und BPD. Die Wirkung von MSZ auf neurologische Schädigung und BPD nach HO ist dennoch weiterhin nur unzureichend verstanden.
Fragestellung: Ziel dieser Arbeit ist ein Hyperoxie-vermitteltes, kombiniertes Schadensmodell in Gehirn und Lunge zu etablieren und anhand dessen die Erprobung des therapeutischen Potenzials einer stammzellbasierten Therapie zu evaluieren.
Methode: Neugeborene Wistar-Ratten wurden postnatal an Tag 2 (P2) einer 7-tägigen HO bei 80% Sauerstoff ausgesetzt. Vor Beginn der HO werden humane MSZ aus der Nabelschur intranasal oder intraperitoneal appliziert, während Kontrolltiere PBS erhielten. Die strukturelle Schädigung wurde in der Lunge mittels histologischer (Hämalaun-Eosin) und immunhistochemischer (IHC) Färbung für pro-Surfactant Protein C (pro-SPC) untersucht, während die Veränderungen der weißen Substanz im Gehirn mittels basischen Myelinprotein analysiert wurde. Auf Gen- und Proteinebene wurden sowohl glattes Muskelaktin, pro-SPC und Aquaporin 5 für die Lunge und Myelin-assoziierte Proteine für das Gehirn detektiert. Des Weiteren wurde die Vaskularisierung mittels IHC-Färbung für von-Willebrand-Faktor und/oder CD31 für beide Organe analysiert.
Ergebnisse: Subakute Analysen (P11) zeigen in Gehirnen von HO-behandelten neonatalen Ratten eine Schädigung der weißen Substanz auf zellulärer als auch Gen- und Proteinebene. Gleichzeitig wurde ein Arrest der Alveolarisierung und reduzierter Vaskularisierung in den Lungen von HO-Tieren nachgewiesen.
Diskussion und Schlussfolgerung: Zahlreiche Studien untersuchen die Sauerstoff-vermittelte Entwicklung von EoP und BPD, jedoch liegen diesen zumeist unterschiedliche experimentelle Modelle zugrunde. In diesem kombinierten Modell konnten Anzeichen einer simultanen Gehirn- und Lungenschädigung aufgezeigt werden, die charakteristisch für EoP und BPD sind. Zusätzlich sollen in 6 Wochen und 6 Monate alten Ratten Verhaltensanalysen durchgeführt werden, um zu erwartende motor-kognitive Veränderungen zu verifizieren. Darüber hinaus bleibt zu klären, welche Wirkung eine präventive MSZ-Behandlung in diesem Modell zeigt.
12:33 Uhr
P10 - 04:
Unterschiede in TLR7/8-Expression und -Signalling sind in die anti-virale Immunantwort Neugeborener involviert
S. Dreschers (Aachen, DE)
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Autor:innen:
S. Dreschers (Aachen, DE)
E. Heiler (Aachen, DE)
T. Orlikowsky (Aachen, DE)
Die angeborene Immunantwort benötigt PAMP Rezeptoren wie Toll-like-Rezeptoren (TLRs) und NOD-like-receptors bzw. RIG-I ähnliche Proteine zur Initialisierung der Abwehrmechanismen.
TLRs erkennen ein breites Spektrum an bakteriellen und viralen Molekülen (PAMPs). TLR3, TLR7 und TLR8 erkennen virale RNA (TLR3: doppelsträngige RNA z.B. in Herpes-, Coxsackie-, Rotaviridiae; TLR7 und TLR8: einzelsträngige RNA z.B. in RSV). Alle drei genannten TLRs sind in den Lysosomen der Monozyten lokalisiert und lösen durch Beteiligung von NF-kappaB und IRF (Interferon-responding-factors) die Bildung von anti-viralen und inflammatorischen Cytokinen aus.
Durch eine neugeborenen-spezifische Expression von TLR7/8 wird die Immunantwort in Richtung anti-virale Cytokin-Produktion angepasst.
Die Verwendung von Imiquimod und Resiquimod stimuliert TLR7/TLR8 in Monozyten und Makrophagen aus Nabelschnurblut und Erwachsenen. Die Dichte der TLRs, die Menge an IFN-alpha und der Transkriptionsfaktoren IRF3, -5- und -7 wurden ermittelt.
TLR7 wurde in einer höheren Dichte in CBMo im Vergleich zu PBMo nachgewiesen (p < 0.01). Dagegen exprimierten mehr PBMo TLR8 (p < 0.01).
Die IFN-alpha Produktion bei Mo ist signifikant durch R837 erhöht, nicht aber durch R848. Der Anstieg ist bei PBMo stärker als bei CBMo. Pro-inflammatorisches TNF-alpha wurde in Mo nur durch R848 induziert, nicht aber durch R837. Im gleichen Zeitraum wird P38 bei PBMo durch R848 Stimulation signifikant stärker phosphoryliert. ERK1/2 wurde durch R848 bei PBMo aktiviert. Bei CBMo erfolgte eine Aktivierung durch R837 und R848 (alle p < 0.05 vs. Kontrolle). Der IRF3 Gehalt blieb in Mo durch R837 und R848 unverändert. IRF5 wurde durch R837 und R848 bei PBMo reduziert, aber in CBMo erhöht. IRF7 wurde bei PBMo durch R837 und R848 aktiviert, bei CBMo aber nur durch R848.
Obwohl die Bildung des anti-viralen Cytokins IFN-alpha bei Neugeborenen per se induzierbar ist, hat eine zum Erwachsenen abweichende TLR7/8 Expression eine Verschiebung zum pro-inflammatorischen Milieu zur Folge. Dies liegt auch in einer abweichenden Aktivierung von IRF5/IRF7.
12:39 Uhr
P10 - 05:
Die Hämophagozytose bei Neugeborenen ist mit starker pro-inflammatorischer Reaktion assoziiert.
S. Dreschers (Aachen, DE)
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Autor:innen:
S. Dreschers (Aachen, DE)
K. Ohl (Aachen, DE)
K. Tenbrock (Aachen, DE)
T. Orlikowsky (Aachen, DE)
Als Hämophagozytose wird die Aufnahme von beschädigten Erythrozyten durch Makrophagen u.a. nach Infektion oder Sepsis bezeichnet (hiervon abweichend die hämophagozytische Lymphohistiozytose als genetisch bedingte Erkrankungen). Hämophagozytose tritt u.a. auch als Folge des Makrophagen- Aktivierungs-Syndrom (MAS) auf und wird in Patienten der juvenilen idiopathischen Arthritis (sJIA) und sytemischem Lupus Erythematosus beobachtet. Die Signaltransduktion umfasst die Aktivierung von TLR7, MYD88, P38, ERK 1/2 und IRF5, die die Bildung pro-inflammatorischer Botenstoffe einleitet.
Wir prüften die Hypothese, ob die durch Hämophagozytose verursachte Zytokinausschüttung bei Neugeborenen im Vergleich zum erwachsenen verstärkt pro-inflammatorisch ist, und ob sie durch Agonisten der beteiligten Toll-like Rezeptoren (TLR) zu modulieren ist. Zu diesem Zweck wurden Makrophagen mit lysierten Erythrozyten und TLR-Rezeptoragonisten ko-inkubiert und Parameter der Phagozytose, TLR-Rezeptordichte sowie Zytokinkonzentrationen (ELISA, FACS) gemessen.
Die TNF-alpha-Sekretion nach Inkubation mit Erythrozyten-Lysaten (RBC) war bei neonatalen Makrophagen im Vergleich zum Erwachsenen bereits nach 4 Stunden signifikant erhöht (p < 0.05). Die anti-inflammatorische Reaktion, repräsentiert durch IL 10-Sekretion, war beim Neugeborenen dagegen erniedrigt, sodass eine vermehrt pro-inflammatorische Zytokinreaktion nach Aufnahme von RBC besteht. Bei ausschließlicher Gabe der TLR-Agonisten fand sich eine deutliche Erhöhung der IL-10-Sekretion in beiden Gruppen, was ein Hinweis auf prinzipielle Modulierbarkeit ist. Die TNF-alpha-Sekretion blieb unbeeinflusst. Die Phagozytosekapazität war bei beiden Gruppen vergleichbar, jedoch konnte R837 die Phagozytose von RBC im Zeitraum von 4h signifikant steigern (p < 0.05).
Der lysosomale TLR7 wurde in einer größeren Zahl adulter als neonataler Makrophagen nachgewiesen (p < 0.05). Die Gabe der TLR7 Agonisten R837 und R848 sowie Erythrozyten Lysate (RBC) hat keinen Einfluss auf die Rezeptordichte von TLR7. Eine veränderte P38 Aktivierung war nicht nachweisbar. ERK 1/2-Phosphoryllierung nach RBC Stimulation wurde ausschließlich in adulten Makrophagen bei R837 bzw. R848 Gabe beobachtet. IRF5 wurde ebenfalls nur bei adulten Makrophagen nach TLR7 Stimulation durch R837 bzw. R848 überexprimiert. Bei neonatalen Makrophagen waren diese Phänomene nicht zu beobachten.
Wurden Makrophagen mit TLR-Agonisten und RBC ko-inkubiert, so fand sich eine Erhöhung der IL-10-Sekretion ausschließlich beim Erwachsenen; beim Neugeborenen war eine Modulation der Immunantwort durch den Agonisten nicht möglich. Die Hämophagozytose kann durch Stimulation des TLR7 Rezeptors mittels Agonisten bei neonatalen Makrophagen eine starke pro-inflammatorische Situation nicht abmildern, was durch ein vermindertes Expressionsprofil von Transkriptionsfaktoren wie IRF5 verursacht werden kann.
12:45 Uhr
P10 - 06:
Expression von Immun-Checkpoint-Molekülen auf adulten und neonatalen T-Zellen
S. Dietz (Tübingen, DE)
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Autor:innen:
S. Dietz (Tübingen, DE)
K. Molnar (Tübingen, DE)
C. Poets (Tübingen, DE)
C. Gille (Heidelberg, DE)
N. Köstlin-Gille (Tübingen, DE)
Hintergrund
Reifgeborene und insbesondere Frühgeborene sind viel anfälliger für schwere bakterielle Infektionen als Erwachsene. Aber nicht nur die Anfälligkeit für Infektionen ist bei Neugeborenen erhöht, sondern auch das Risiko für die Entwicklung postinflammatorischer Erkrankungen wie die bronchopulmonale Dysplasie (BPD). Dies kann auf eine beeinträchtigte Fähigkeit zurückzuführen sein, Entzündungen zu beenden. In dieser Studie untersuchten wir die T-Zellproliferation von neonatalen T-Zellen im Vergleich zu erwachsenen T-Zellen, sowie die Expression von Immun-Checkpoint-Molekülen (ICM) und Aktivierungsmarkern auf neonatalen T-Zellen im Vergleich zu erwachsenen T-Zellen.
Hypothese
Eine erhöhte Aktivierung neonataler T-Zellen nach bakterieller Stimulation kann bei Neugeborenen zu einer anhaltenden Entzündungsreaktion beitragen.
Methoden
Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes von Erwachsenen (PBMC) und aus Nabelschnurblut (CBMC) wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation aufgereinigt Die Expression der ICM und Aktivierungsmarkern wurde durchflusszytometrisch analysiert. Die Stimulation mit Bakterien erfolgte bei E. coli und GBS mit einer MOI zu 1:50.
Ergebnisse
Neonatale T-Zellen hatten eine erhöhte Proliferationskapazität und eine erhöhte Expression von Aktivierungsmarkern im Vergleich zu erwachsenen T-Zellen nach Stimulation mit OKT3 sowie eine verminderte Expression von ICM, insbesondere PD-L1, auf ihrer Oberfläche. Diese verminderte Expression von PD-L1 durch neonatale T-Zellen wurde auch nach Stimulation mit GBS, nicht aber nach Stimulation mit E. coli, den beiden wichtigsten Krankheitserregern bei neonataler Sepsis, gezeigt. Die Expression des T-Zell-Rezeptors CD3 und des ko-stimulatorischen Moleküls CD28 unterschied sich nicht zwischen erwachsenen und neonatalen T-Zellen nach bakterieller Stimulation.
Schlussfolgerung
Die verringerte Expression von ICM bei der Aktivierung von T-Zellen könnte ein Grund für das erhöhte Risiko von Neugeborenen sein, postinflammatorische Krankheiten zu entwickeln.
12:51 Uhr
P10 - 07:
Probiotika beeinflussen die Immunantwort von Nabelschnurblut-Monozyten in vitro
J. Rühle (Tübingen, DE)
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Autor:innen:
J. Rühle (Tübingen, DE)
X. Rückle (Tübingen, DE)
S. Dietz (Tübingen, DE)
J. Hebel (Tübingen, DE)
C. Gille (Heidelberg, DE)
C. Poets (Tübingen, DE)
N. Köstlin-Gille (Tübingen, DE)
Hintergrund:
Das Mikrobiom spielt eine wichtige Rolle für die Gesunderhaltung und die Krankheitsentstehung. Eine Modulation des Mikrobioms mit Probiotika wirkt sich günstig auf die Entstehung verschiedenster Erkrankungen aus. In der Neonatologie werden Probiotika vor allem zur Prävention der nekrotisierenden Enterokolitis (NEC) eingesetzt. Die Mechanismen, über die Probiotika wirken sind vielfältig. Beispielsweise fördern sie die Produktion immunologisch wirksamer Metabolite oder induzieren die Bildung regulatorischer Immunzellen. Über ihre direkte Wirkung auf neonatale Monozyten ist bisher allerdings nur wenig bekannt.
Hypothese:
Verschiedene probiotische Stämme verändern die Immunantwort von Monozyten aus humanem Nabelschnurblut in vitro.
Methoden: Monozyten wurden aus mononuklearen Zellen aus dem Nabelschnurblut isoliert und anschließend mit drei unterschiedlichen probiotischen Stämmen (Lactobacillus rhamnosus (LR), Lactobacillus acidophilus (LA) und Bifidobacterium bifidum (BB)) und Kombinationen aus diesen in unterschiedlichen Konzentrationen (multiplicity of infection: MOI 1:0.1 und 1:1) stimuliert. In manchen Versuchen erfolgte eine gleichzeitige Stimulation der Zellen mit Lipopolysaccharid (LPS). Es wurde dann die Expression von Oberflächenmolekülen (CD16, CD80, CD86, TLR2, TLR4, PD-L1, CD18) auf Monozyten und die Produktion pro- und antiinflammatorischer Zytokine (IL-1β, IL-8, TNF- α, TGF-β) sowie die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) durchflusszytometrisch analysiert.
Ergebnisse:
Die Stimulation von neonatalen Monozyten mit LR erzeugte proinflammatorische Effekte. Durch Stimulation von neonatalen Monozyten mit LR kam es zu einer erhöhten Expression von Oberflächenmolekülen, die an der Monozytenaktivierung beteiligt sind, einer erhöhten Produktion von proinflammatorischen und regulatorischen Zytokinen sowie einer verstärkten Produktion von ROS. Ähnliche Effekte wurden beobachtet, wenn die Monozyten gleichzeitig zur Stimulation mit LR mit LPS stimuliert wurden. Eine Stimulation mit LA und BB allein oder in Kombination induzierte ebenfalls eine erhöhte Zytokinproduktion durch Monozyten, wobei BB die geringsten proinflammatorischen Effekte zeigte.
Schlussfolgerung:
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Probiotika die Abwehrfunktionen der neonatalen Monozyten erhöhen und damit möglicherweise die Fähigkeit des Neugeborenen, Infektionen zu bekämpfen, positiv beeinflussen können.