Autor:innen:
D. Tümen (Regensburg, DE)
B. Volz (Regensburg, DE)
E. Aschenbrenner (Regensburg, DE)
J. Teubner (Regensburg, DE)
D. Truong (München, DE)
K. Neumeyer (Regensburg, DE)
M. Gunckel (Regensburg, DE)
K. Pollinger (Regensburg, DE)
P. Mester-Pavel (Regensburg, DE)
M. Michalski (Regensburg, DE)
V. Albert (Regensburg, DE)
C. Kunst (Regensburg, DE)
K. Gülow (Regensburg, DE)
M. Müller-Schilling (Regensburg, DE)
Einleitung: Wir haben ein integrierbares Exon-Spezifisches Isoform-Expressions Reporter System (EXSISERS) zur Echtzeit-Quantifizierung von Protein Isoformen entwickelt (Truong et al. Nat Cell Biol, 2021). Unsere Methode kann aufwändige Protein-Nachweisverfahren ersetzen und kleinste zeitliche Veränderungen in der Expression nachweisen. Zudem ist EXSISERS universell für jedes Protein anwendbar. Das Tumorsuppressorgen TP53 kodiert für 12 verschiedene Protein-Isoformen, über deren Zusammenwirken noch wenig bekannt ist. Die Integration von EXSISERS in drei verschiedenen Loci (Exon 2, 4 und 7), ermöglicht es uns die drei wichtigsten p53 Isoform-Hauptgruppen Full Length p53 (FLp53), Δ40p53 und Δ133p53) zu quantifizieren. FLp53 und Δ40p53 gehören zu den pro-apoptotischen Protein-Isoformen, während Δ133p53 zu den anti-apoptotischen Protein Isoformen zählt. Das Verhältnis dieser p53 Isoformen entscheidet über die Aktivierung p53-abhängiger Signalwege und über das Ansprechen auf eine Anti-Tumortherapie. Wir berichten hier über eine weitere klinisch relevante Eigenschaft unserer Methode: Die Möglichkeit, EXSISERS in Hochdurchsatz-Screens – hier am Beispiel des kolorektalen Karzinoms (KRK) – anzuwenden.
Methode: EXSISERS ist ein von Split-Inteinen flankiertes Luciferase-basiertes Reportersystem. Split-Inteine initiieren post-translationales Spleißen des Luciferase-Reporters aus p53 und gewährleisten die Integrität des Wirtsproteins. Durch das Auslesen der Lumineszenz, können wir die Quantität der p53 Isoformen in Echtzeit in HCT116-Zellen bestimmen. Um neue Substanzen zur Behandlung des KRKs zu identifizieren, wurden in einem Hochdurchsatz-Screening 5.000 Anti-Tumor Wirkstoffe (MCE, HY L025) hinsichtlich der differenziellen p53 Protein Isoform-Expression untersucht.
Ergebnisse: Durch unser EXSISERS-basiertes Hochdurchsatz-Screening konnten wir zwei hochwirksame Wirkstoffkandidaten identifizieren, die in der KRK-Zelllinie HCT116 pro apoptotisches p53 (FLp53, Δ40p53) hochregulieren und effizient Zelltod induzieren. Deren Wirksamkeit validierten wir durch Viabilitäts- und Zelltod-Assays an verschiedenen KRK-Zelllinien (HCT116, Caco-2, HCT15, HT29 und SW480), sowie an Organoiden aus KRK-Biopsien und normaler Kolon-Schleimhaut. Diese Wirkstoffe wirken tumorspezifisch und lösen in Organoiden aus normalem Schleimhautgewebe nur geringfügig Zelltod aus. Die identifizierten Substanzen wirken im nano-molaren Konzentrationsbereich.
Schlussfolgerung: Durch die Anwendung von EXSISERS auf eine Anti-Tumor Wirkstoff Library konnten wir zwei Substanzen identifizieren, die die pro-apoptotischen p53 Isoformen FLp53 und Δ40p53 hochregulieren und im nano-molaren Konzentrationsbereich tumorspezifisch Zelltod auslösen. EXSISERS in Kombination mit einem Hochdurchsatz-Screening erlaubt somit die Identifikation neuer Wirkstoffkandidaten für die Therapie des kolorektalen Karzinoms.